外泌體（Exosomes）是由內體衍生的小型脂質納米顆粒，直徑約 30-200 納米，大多數活細胞會通過胞吐作用主動分泌外泌體?[1]。無論是在病理還是生理狀態下，外泌體的釋放既可以是持續性的，也可以是誘導性的，且釋放過程具有動態性、可控性和功能相關性。外泌體的分子組成與釋放量取決于其來源細胞的狀態。外泌體可從多種細胞系、原代培養物中分離獲得，也可從血清、血漿、唾液等生物體液中提取。鑒于來源的多樣性，外泌體具有多效的生理功能，且越來越多的研究表明，其在癌癥、感染性疾病、神經退行性疾病等多種病理狀態中發揮著重要作用。因此，外泌體成為液體活檢方法中的關鍵研究對象?[2]。此外，外泌體還可通過工程改造，成為極具潛力的藥物遞送載體?[3]。
由于外泌體體積微小，從復雜的生物基質中分離外泌體頗具挑戰性，且分離產量通常較低。在此背景下，Simple Western?成為研究外泌體的理想技術：該方法僅需 3 微升樣品，且具備皮克級靈敏度，大幅減少了傳統Western blot對所需外泌體量的要求。隨后，可使用針對外泌體相關抗原的特異性檢測抗體對之進行表征分析 —— 這些目標抗原既可以是外泌體的通用標志物，也可以是其來源細胞或體液所特有的標志物。本實驗方案中，我們將利用市售的外泌體標準品和抗體，通過Simple Western?檢測外泌體的通用標志物和來源特異性標志物。
本篇文章介紹以“人血漿、人血清、人A549細胞（肺泡基底上皮腺癌細胞）”三種外泌體標準品為對象，驗證下表中抗體的有效性的結果：
01. 通用外泌體標志物的表達
? Flotillin-1：作為經典通用標志物，在三種標準品中均檢測到（圖1A）。
? Alix：在三種標準品中均有表達，但A549細胞來源外泌體中表達量更高（圖1D）。
02. 來源特異性標志物的表達
? Annexin V：作為凋亡標志物與血液抗凝蛋白，在A549細胞、血漿來源外泌體中檢測到，在血清來源外泌體中未檢測到（圖1B）。
? EGFR（HER1）：僅在A549細胞來源外泌體中檢測到，血清、血漿來源外泌體中無信號（圖1C）。
圖 1 利用Simple Western?測外泌體目標抗原。A：flotillin-1；B：Annexin V；C：EGFR；D：Alix。
03. 特殊處理需求的標志物
? CD63：僅當用PNGase F（去糖基化酶）處理外泌體標準品后，才可檢測到信號，提示糖基化修飾對該標志物檢測的影響（圖2）。
04. 其他標志物驗證
表2中其余抗體（如Annexin A2、HSPA8/HSC70、TSG101等）均通過Simple Western驗證，可在對應外泌體標準品中檢測到目標信號（圖2）。
圖2. 在血漿和 A549 細胞來源的外泌體標準品中，各目標抗原的檢測泳道視圖。
—— Simple Western技術核心價值 ——
(1) 微量高效：僅需3-5μL外泌體裂解液（傳統WB需50μL+），適配珍貴樣本；毛細管全流程減少樣本損耗，適合低豐度膜蛋白。
(2) 高靈敏度：皮克級檢測下限，可測CD63/Alix等，經PNGase F處理破解糖基化干擾，實現EGFR等特異性檢測。
(3) 抗基質干擾：12-230kDa毛細管電泳去雜，外泌體裂解后可直接上機，無需繁瑣純化。
(4) 多重定量：單樣本同步測8個靶點，符合MISEV標準，動態范圍覆蓋6個數量級。
(5) 自動化流程：3小時全自動化出結果，減少蛋白降解；每孔獨立質控，滿足外泌體制備QC。
(6) 精準定量：支持絕對/相對定量，低樣本量+高重復性，適配液體活檢標志物開發，加速科研到臨床轉化。
* 參考文獻:
1. Exosomes, D M Pegtel and S J Gould, Annual Review of Biochemistry, 2019, 88:487–514.
2. Extracellular vesicles – biomarkers and effectors of the cellular interactome in cancer, J Rak, Frontiers in Pharmacology, 2013, 4:21.
3. Exosomes as reconfigurable therapeutic systems, R Conlan, S Pisano, M Oliveira, M Ferrari and I Mendes Pinto, Trends in Molecular Medicine, 2017, 23(7):636–650.
* 本文轉載自「ProteinSimple」微信公眾號
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