在寡核苷酸的應用市場中，診斷行業增長迅速——檢測方法的進步是最重要的驅動力，尤其是qPCR和測序技術的發展。方法的進步反過來對原料組分提出新的以及更高要求，需要新的和改進的檢測標記（例如熒光基團、電化學標記等）不斷打磨檢測方法以追求更高的靈敏度和選擇性。
在與修飾寡核苷酸應用相關的診斷測試手段中，熒光檢測（如基于熒光探針的qPCR）是極其重要的一類技術。
下文將基于該類檢測技術，結合LGC, Biosearch Technologies?的NAC產品組合，重點介紹寡核苷酸修飾子/標簽及其在診斷寡核苷酸合成中的應用。
熒光檢測（Fluorescence detection）
染料標記的寡核苷酸具有許多重要的生化和分析用途。對例如DNA Sanger測序和原位雜交（如FISH）的某些特定應用，寡核苷酸需要單一標記，后續依賴染料的熒光特性進行檢測分析——大部分發出可見光譜的光。
其它類型的寡核苷酸，例如用于DNA/RNA實時熒光定量檢測的探針（熒光基團-淬滅劑探針）和用于等位基因鑒別的探針（分子信標），均為雙重標記。在使用熒光基團/淬滅劑對的應用中，動態淬滅通過FRET（熒光共振能量轉移）或碰撞淬滅發生。大多數情況下，淬滅機制取決于淬滅劑。例如BHQ?屬于FRET淬滅劑，而Dabcyl通過碰撞起作用：后者與消光系數無關，而在FRET中高消光系數很重要——這也是BHQ系列淬滅效率高的原因。產生有效淬滅還必須考慮熒光供體發射光譜和受體吸收光譜的重疊。
無論淬滅機制如何，結果基本一致。雙標探針（Taqman?探針、分子信標、蝎形引物等）與PCR形成的擴增子雜交，熒光基團與淬滅劑分離。這種機制與探針類型有關，但一般來說，要么探針打開，增加熒光基團與淬滅劑之間的距離使淬滅停止（分子信標），要么熒光基團或淬滅劑從探針（Taqman探針）上裂解（最常見）。
熒光基團/淬滅劑對的選擇取決于熒光基團的發射波長，即所需的檢測信號。然而有些時候需要修改熒光基團的發射波長：通常使用FAM/ROX/淬滅劑（如DDQ-I）的組合。在這種情況下有兩個供體-受體相互作用：FAM/ROX組合改變了信號的波長，而淬滅劑作為FAM/ROX發射光的受體。
一、熒光分子
1.1 TAMRA標記
這是基于寡核苷酸的應用中最常用的羅丹明染料。TAMRA的熒光特性有時用于寡核苷酸標記，但TAMRA更常用作淬滅劑。
1.2 熒光素標記
寡核苷酸標記熒光素類染料的方法有多種，且標記的選擇多樣化，跟芳香環的氯化程度有關——這決定了染料的熒光發射。衍生自單異構體6-羧基熒光素的5’-Fluorescein-CE Phosphoramidite (6-FAM, LK2134)、5’-Hexachloro-fluorescein-CE Phosphoramidite (HEX, LK2136)和5’-Tetrachlorofluorescein-CE Phosphoramidite (TET, LK2137)均可用于寡核苷酸5’端的有效標記。
LINK還提供另外兩種可用于寡核苷酸熒光素標記的亞磷酰胺：6-Fluorescein-CE Phosphoramidite (LK2139)和Fluorescein-CE Phosphoramidite (LK2148)。兩種單體都包含與LK2134相同的熒光染料，但連接骨架不同。LK2139具有1,3-二醇結構，其中額外的OH受DMTr保護。這不但可以通過DMTr的釋放監測偶聯效率，而且還可以在寡核苷酸中進行多次添加，可用于染色體涂染等。然而，這通常需要在每次添加之間加入一個接頭（例如spacer-18 LK2129），防止熒光素自淬滅。Fluorescein-CE Phosphoramidite (LK2148)提供了與LK2139相同的可能性，但該種情況下接頭通過硫脲鍵連接至熒光素。
熒光素的序列內部添加可通過使用Fluorescein-dT-CE Phosphoramidite (LK2068) 取代任意適合的dT殘基實現。同樣，可以進行多次添加，但每個fluorescein-dT之間的間距對防止自淬滅至關重要。
寡核苷酸3’端熒光素的標記可通過使用四種不同載體實現?；谌〈鸁晒馑?-異構體的3’-Fluorescein CPG (LK2359)，以及由6-FAM制備的3’-(6-Fluorescein) CPG (LK2368)，通常均用于此目的。此外，還有同樣源自 6-羧基熒光素的 3'-(6-FAM) CPG (LK2366) 和Fluorescein-dT CPG (LK2370)；其中LK2366可以有效阻斷聚合酶向3’末端的延伸以及核酸外切酶活性。
1.3 菁染料Cyanine dyes（包括Quasar?染料）
菁染料作為熒光標記的寡核苷酸主要用于分子診斷中的探針制備，例如real-time PCR、熒光原位雜交（FISH）、以及基于表面增強共振拉曼光譜（SERRS）的DNA檢測。它們的發射光譜可以通過改變聚甲炔鏈的長度來調節，并且可以通過芳環上的取代基來改變它們在有機或水性溶劑中的溶解度。
最常用的亞磷酰胺染料是Cyanine-3 (LK2520)和Cyanine-5 (LK2521)。這些通常在合成過程中連接到寡核苷酸的5'端，但也很容易摻入序列中間。MMT保護的羥基的去除方式與 DMTr保護相同。由于結構中缺乏雜環堿基，序列中間摻入并不常見，而且不具備參與堿基配對的能力——會使形成的雙鏈不穩定。
對于3'-修飾，我們引入了等效的3'-修飾1000 ? CPG載體，3'-Cyanine-3 (LK2412) 和3'-Cyanine-5 (LK2413)。
Quasar染料570和670（分別以亞磷酰胺LK2158和LK2159的形式提供）是熒光吲哚羰菁，在橙黃色（LK2158）和紅色（LK2159）區域發出熒光的可見光譜。這兩種染料在熒光探針標記中的應用直接同功于常見的菁染料（Cy?），Quasar570類似cyanine-3/Cy3，Quasar670類似cyanine-5/Cy5。與LK2520和LK2521不同，Quasar染料不能在寡核苷酸序列中間添加。
1.4 CAL Fluor?染料
CAL Fluor染料是一組專門為qPCR儀器設計的熒光染料。這些新型的呫噸熒光基團可以替代以前的染料，是低成本的替代品。染料可以高效制造，并且在寡核苷酸合成及后處理條件下保持穩定。將CAL Fluor染料與生物分子連接的連接化學消除了多種異構體的問題。這使得染料標記更易于制造、具有單個 RP-HPLC 峰并具有明確的發射光譜。
CAL Fluor染料以CPG和亞磷酰胺單體的形式提供，最大發射波長為520nm至635nm，可與BHQ-1或BHQ-2配對。
1.5 ROX (6-carboxy-X-rhodamine) 標記
ROC熒光染料（羧基-X-羅丹明）通常用作被動參比染料，為熒光報告染料（即多重qPCR或real-time PCR中的SYBR Green I或TaqMan探針）提供穩定的基線?；€還允許校正移液誤差、熒光波動和儀器漂移，例如燈強度輸出隨時間的變化。由于染料不會干擾qPCR擴增，因此將恒定量添加到所有樣品中作為對照。
根據實驗期間使用的濾光鏡和real-time PCR儀器，可能需要調整ROX的濃度。早期的real-time PCR儀器沒有匹配ROX的濾光鏡，因此需要高濃度來建立基線。后來的儀器使用內標解決了這一短板，以校正光強度。由于ROX染料與所有PCR儀器兼容，后來的儀器現在已針對ROX光譜設置進行校準，因此無需重新校準熱循環儀。
表1：染料/淬滅劑選擇表
（染料按吸光度最大值的順序列出；色標僅用作圖形表示）
二、淬滅劑
2.1 TAMRA標記
TAMRA 的光吸收特性以及與幾種常用熒光團（包括FAM、HEX、TET和JOE）的光譜重疊，使其可用作設計雙標探針的淬滅劑。然而，TAMRA的用處有限，因為它的發射光譜廣，這降低了它在多重檢測中應用的能力。其固有熒光產生背景信號，會潛在降低基于TAMRA檢測的靈敏度。盡管存在這些限制，TAMRA已廣泛用于檢測探針的設計，尤其是用于Real-Time PCR的Taqman探針。
寡核苷酸可以使用兩種不同的方法標記TAMRA。TAMRA對強堿不夠穩定，且在氫氧化銨存在下降解。如果需要去保護，則在寡核苷酸的3'-（最常見）或5'-末端合成氨基，并使用TAMRA-NHS酯進行合成后TAMRA標記。使用溫和的去保護單體合成的寡核苷酸可以直接用TAMRA標記，或者在序列中間通過用TAMRA-dT-CE Phosphoramidite (LK2143) 取代任何合適的dT殘基，或者在3'-末端使用3'-TAMRA CPG載體 (LK2434)。隨后寡核苷酸的脫保護在70?C下使用叔丁胺/甲醇/水（1:1:2）處理2.5小時完成。盡管仍有少量TAMRA降解，但在純化過程中很容易去除。如前所述，TAMRA也是一種熒光基團，雖然是使用最廣泛的淬滅劑之一，但應用中通常需要使用黑暗淬滅劑（Dark Quencher）。
2.2 非熒光淬滅劑（Dark Quenchers）
（1）Dabcyl標記
Dabcyl由于其吸光特性且無殘留熒光，已被廣泛用作診斷探針（如分子信標）中的淬滅劑。在非活性狀態下，分子信標不與靶序列雜交，熒光基團的熒光能量通過碰撞淬滅過程轉移至淬滅劑。為了有效地進行光能轉移，熒光基團和淬滅劑必須非?？拷?。分子信標的設計中考慮了這一要求，因為莖的兩部分雜交以保持F/Q非?？拷木嚯x。分子信標探針與其靶序列的雜交導致莖的分離，從而導致F/Q對的分離，產生熒光。
由于dabcyl對寡核苷酸合成過程穩定，它可以通過修飾子的形式在序列中的任何位置摻入：在5'端使用5'-Dabcyl-CE Phosphoramidite (LK2085) - 例如在TwistAmp fpg探針上的使用；在3'端使用3'-Dabcyl CPG (LK2374) - 例如用于Taqman探針、蝎形引物和分子信標；或在序列中間使用 Dabcyl-dT-CE Phosphoramidite (LK2144) - 例如在蝎形引物中。
Dabcyl的吸收特性將其可淬滅的染料范圍限制為發射波長為400-550nm（最大吸收波長為471nm）的染料。然而，當在分子信標中使用時，Dabcyl和熒光基團足夠接近，進而可以淬滅稍寬光譜的染料，從而增加了Dabcyl分子的通用性。
Dabcyl在大多數情況下已被BHQ系列染料取代。
（2）黑洞淬滅劑試劑
現代基因組和診斷應用的需求通常集中在對更高檢測靈敏度的日益增長的需求上，這導致了一系列新的非熒光淬滅劑的開發。其中最著名的是Black Hole Quencher?試劑（BHQ 試劑），它專門針對基于FRET的淬滅進行了優化。
由于每種BHQ染料具有高消光系數和寬光譜重疊，因此與Dabcyl等分子相比，淬滅效率有所提高。這反過來意味著BHQ染料為不同檢測目的提供了更大范圍波長的使用，覆蓋可見光到光譜的近紅外區域（480-730nm）。再加上這些分子沒有殘留背景熒光（是真正的暗淬滅劑），使BHQ染料成為real-time PCR應用的有利選擇。
在四種BHQ淬滅劑中，BHQ-1和BHQ-2更受歡迎，無論5’-Phosphoramidites (LK2154和LK2155)、dT-Phosphoramidites (LK2156和LK2157)，或是3’-CPG (LK2379和LK2380)。如果僅考慮激發和發射值，Cy5、Cyanine-5和Quasar 670需要BHQ-3才能有效淬火，但建議使用BHQ-2，因為它不易降解。BHQ-1通常用于在480-580nm范圍內的淬滅，可與常用熒光基團配合使用，如FAM、TET、JOE和HEX。BHQ-2用于在550-650nm范圍內的淬滅，淬滅TAMRA、ROX、Cyanine-3、Cy3、Cy3.5?和Red 640等熒光基團最為有效。每種BHQ亞磷酰胺和CPG均可直接用于自動化合成。
（3）Deep Dark Quencher 1（DDQ-1）
Deep Dark Quencher 1是一種非熒光分子，可淬滅FAM等較短波長的染料，其淬滅特性與Dabcyl非常相似（見下圖）。該修飾可以使用3’-modifier CPG 1000 ? support (LK2349)實現。
圖1：3'-Dabcyl- 和 3'-DDQ-1- 標記寡核苷酸的紫外吸收光譜比較
（DDQ-1 λmax471nm，Dabcyl λmax473nm）
該種情況下，淬滅劑連接到脫氧核糖的端基異構位置。這消除了在去保護過程中丟失標簽的可能性——由于1,2-二醇構型，該問題通常也與Dabcyl相關。此外，DDQ-1的摻入導致天然糖-磷酸骨架的保留，意味著對寡核苷酸的結構沒有不利影響。
圖2：多重qPCR熒光基團/淬滅劑在線選擇工具
https://www.biosearchtech.com/qpcr-multiplex-spectral-overlay-tool
（4）BlackBerry?淬滅劑
熒光基團在激發態時對環境敏感，除了熒光光子的發射，還可能通過多個過程丟失激發能量。這種熒光淬滅的發生可以通過：碰撞或分子運動（動態淬滅），與其他分子的激發態反應（光漂白），接觸淬滅（形成非熒光基態復合物，也稱為靜態淬滅），或熒光共振能量轉移（FRET）。許多核酸熒光檢測技術使用帶有熒光基團和淬滅劑的探針，依靠FRET或接觸模式淬滅來減弱熒光，直到探針雜交發生。雜交后，熒光基團和淬滅劑在空間上分離，導致熒光增強。FRET從熒光基團到淬滅劑的效率（即淬滅量級）取決于它們躍遷偶極子的相對定向、它們之間的距離、以及淬滅劑吸收光譜與熒光基團發射光譜的重疊程度。接觸淬滅的效率取決于熒光基團和淬滅劑形成基態復合物的能力，并與兩種物質的相互親和力以及它們之間的距離相關。淬滅劑本身可能是發射熒光的，發射波長比受體熒光基團更長的光子。
使用黑暗淬滅劑（dark quenchers）更加方便——它們是非熒光發色團，在FRET模式下可以從熒光基團的激發態吸收能量，從而阻止熒光光子的發射。黑暗淬滅劑的激發態產物通過非輻射衰變（熱）弛豫至基態。在接觸模式下，黑暗淬滅劑與熒光基團形成非熒光基態復合物，掩蓋其熒光，直至雜交發生。
典型的黑暗淬滅劑是Dabcyl。這種淬滅劑的一個理想特性是長波長吸收最大值?？上У氖谴祟惢衔锏幕瘜W穩定性經常降低。擴展的 π 系統和/或使用更強的供體受體官能團配對可導致對寡核苷酸合成試劑的敏感性，例如碘氧化劑、以及氨和 AMA 等Deblock試劑。
LGC, Biosearch Technologies提供BlackBerry Quencher 650 (BBQ-650)作為合成穩定的長波長熒光黑暗淬滅劑（圖3）。8-alkoxyjulolide部分是強大的 π -電子供體，與相關化合物相比，它提供了驚人的紅移。BBQ-650標記寡核苷酸的吸收光譜如圖4所示。以650nm為中心的寬吸收譜有效地與流行的長波長熒光基團（例如Cy3、TAMRA、Texas Red、ROX、Cy5和Cy5.5）的發射最大值重疊，從而實現高效淬滅。
圖3：BlackBerry Quencher 650 (BBQ-650)
圖4：3’ BBQ-650標記的15-mer寡核苷酸的吸收光譜
BlackBerry Quenchers可以使用圖 5中所示的試劑裝配在寡核苷酸的3'末端、序列中間或5'位置。為了在接觸淬滅模式下評估BlackBerry Quencher 650，使用3'-BBQ-650 CPG合成了帶有多種5'-熒光基團（FAM、Cy3?、Texas Red、Cy5?、Cy5.5?）的分子信標探針：與完全互補靶標序列結合后的信噪比非常好，例如，Cy5 > 90，Cy5.5 > 88。
圖5：BlackBerry Quencher 650的寡核苷酸合成試劑
BlackBerry Quencher 650是出色的FRET淬滅劑。在5'-Cy5.5熒光基團與3'-BBQ-650間距5個或10 個以內堿基對（20-40?）的互補鏈配對中，仍可分別觀察到≥98.3%和≥98.9%的淬滅效率。這些雜交體的熔解溫度與未標記核酸雜交體相比沒有變化，表明高淬滅效率來自FRET淬滅而非接觸淬滅。
（5）Blueberry淬滅劑
LGC, Biosearch Technologies開發了一系列新的pH敏感淬滅劑。根據pH值調節吸光度的能力使這些淬滅劑與市場上的其他淬滅劑區分開來。
細胞環境中的成像離子是推進臨床診斷、生化研究和環境科學等專業研究的持續挑戰。該領域已從熒光鈣成像指示劑的發明擴展至包括各種傳感工具，其中之一是納米級離子選擇性光極。這些納米級光極是離子選擇性電極的等效物，且提供優于傳統分子指示劑的優勢——識別部分和光學報告分子是分開的組件。這種模塊化結構使得調諧傳感器的動態范圍、靈敏度、波長和選擇性成為可能。
克服因使用Nile red系列熒光指示劑而產生的光極限制的研究工作正在進行Ref 1，其中一個關鍵步驟是成功使用淬滅劑染料Blueberry-C6-ester-652 (BLU00652) 替代了鉀離子特異性納米傳感器配方中更為傳統的顯色離子載體 III (CH III)。圖6顯示了pH敏感的Blueberry-C6-ester-652與離子選擇性光極中的靜態熒光基團一起使用時的傳感器機制。淬滅劑的吸光度隨鉀離子提取而變化，進而導致淬滅劑和熒光基團之間的FRET變化。圖7 顯示了消光系數表征(A)和pH滴定 (B)。
圖6：基于pH的鉀納米傳感器機制
圖7：Blueberry-C6-ester-652淬滅染料：
(A) 消光系數表征和 (B) 在CH3CN/緩沖液 (1:1) 中的pH滴定
Ref 1 Development of an Optical Nanosensor Incorporating a Novel Quencher Dye for Potassium Imaging, Sahari, A.; Ruckh, T.; Hutchings, R.; Clark, H. submitted to Anal. Chem.2015.
除了Blueberry-C6-ester-652 (BLU00652)，LGC, Biosearch Technologies還提供所有Blueberry淬滅劑，包括Blueberry pyridyl C6 ester（最大吸收波長556nm，pKa為5.6且e= 36,750 M-1 cm-1），以及Blueberry-cyano-C6-ester（BLU00655，最大吸收波長623nm，pKa為8.0且e= 24,500 M-1 cm-1）。這些淬滅劑呈現出450nm~700nm的寬吸收范圍，并涵蓋了廣泛的生理學相關pKa值。
* 本文轉載自「LGC基因組學」微信公眾號
